Enregistrement et coloration juxtacellulaires pour une cartographie précise de l’activité neuronale chez un rat éveillé

Résumé

Source : Moore, J. D., et al. Surveillance juxtacellulaire et localisation de neurones uniques au sein des structures cérébrales sous-corticales de rats alertes et retenus par la tête. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre la méthode d’enregistrement et de coloration juxtacellulaire chez un rat atténué et éveillé. La procédure consiste à enregistrer les signaux des neurones et à injecter un colorant pour localiser précisément le site d’enregistrement. Cette technique permet une cartographie précise de l’activité neuronale à la structure anatomique du cerveau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de soins aux animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Surveillance juxtacellulaire des unités neuronales

1. Tirez un tube capillaire en quartz sur un extracteur de micropipette laser à dioxyde de carbone (voir la section Matériaux) avec des diamètres de pointe inférieurs à 1 μm (Figure 2A).
   REMARQUE : Les paramètres de chauffage varient en fonction de l’instrument particulier, et le diamètre du cou requis varie en fonction de la structure cérébrale d’intérêt. Pour les enregistrements dans le thalamus du rat, les micropipettes ont des cols allant de 5 à 7 mm.
2. Fixez la pipette en place sous un microscope à contraste interférentiel différentiel (DIC) équipé d’objectifs à longue distance de travail. Utilisez de la pâte à modeler pour maintenir la pipette en place sur la platine du microscope.
3. Déplacez lentement une brique de verre (0,5 à 1 cm d’épaisseur ; un morceau de verre utilisé pour fabriquer des couteaux à ultra-microtome est pratique) dans le champ de vision avec la pointe de la pipette. À l’aide du micromanipulateur de platine, touchez doucement la pointe de la pipette au verre, ce qui la brise. Répétez l’opération si nécessaire jusqu’à ce que le diamètre extérieur de la pointe de la pipette soit compris entre 1 et 3 μm (Figure 2B, C). Assurez-vous que ces micropipettes ont des impédances comprises entre 5 et 15 MΩ environ.
4. Préparez une solution saline extracellulaire (135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, 5 mM d’HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique), pH 7,2 avec NaOH) et ajoutez 2 % (p/v) de Chicago Sky Blue. Remplissez l’extrémité arrière de la pipette avec la solution à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 30 G ou moins. Alternativement, pour le marquage juxtacellulaire unicellulaire, ajoutez 2 % (p/v) de neurobiotine ou de dextran amine biotinylée (BDA-3000 ou BDA-10000) à la solution saline à la place de Chicago Sky Blue.
5. Placez le rat à l’intérieur de la chaussette en tissu à l’intérieur du tube rigide sur un gabarit expérimental approprié (Figure 1). Attendre au moins 72 heures après l’intervention chirurgicale avant de placer l’animal sur le gabarit d’appuie-tête. Serrez le cordon de serrage autour de la partie supérieure du sternum, plutôt que du cou, pour éviter l’obstruction des voies respiratoires. Si la respiration semble laborieuse ou obstruée, desserrez le cordon de serrage ou déplacez-le vers l’arrière. Effectuez cette procédure pendant que le rat est en alerte.
6. Fixez la plaque de retenue de la tête sur le rat à la pièce correspondante sur le gabarit. Pour ce faire, épinglez d’abord la plaque d’appuie-tête en place, puis fixez-la à l’aide d’une vis 4-40. Assurez-vous d’attendre que l’animal soit calme afin d’éviter d’appliquer un couple excessif à la tête. Ensuite, placez un écrou 8-32 sur le boulon de retenue de la tête qui est implanté dans le rat. Vissez ensuite une tige filetée en acier inoxydable sur le boulon de tête. Fixez la tige au gabarit expérimental de manière à ce qu’elle puisse être serrée en place (Figure 1).
   REMARQUE : La fixation de l’animal avec le boulon de tête ainsi que la plaque d’appuie-tête minimise la flexion de l’appareil et améliore la stabilité de l’enregistrement. Dans la plupart des cas, l’enregistrement peut commencer le premier jour où l’animal est attaché à la tête. Cependant, si l’animal s’agite excessivement ou vocalise, donnez-lui une journée de formation à l’habituation à l’appuie-tête avant de commencer tout enregistrement. Dans ce cas, laissez l’animal sur le gabarit pendant 15 min puis remettez-le dans sa cage. Répétez cette étape le lendemain et continuez avec le protocole.
7. Ouvrez la chambre d’enregistrement et retirez le gel de silicone. Si du tissu a repoussé dans la craniotomie, nettoyez-le à l’aide d’une pince fine.
8. Fixez la pipette au micromanipulateur motorisé et branchez le préamplificateur de la tête de toit.
   REMARQUE : Dans la présente démonstration, un petit circuit de relais sur l’étage de tête commute entre les fils conducteurs de l’amplificateur et une source de courant externe avec une conformité élevée(Figure 3A-C). Notez que certains amplificateurs disposent d’une source intégrée appropriée à haute conformité.
9. À l’aide du micromanipulateur motorisé, déplacez la pointe de la pipette jusqu’à la marque stéréotaxiquement identifiée dans la chambre d’enregistrement. Notez les coordonnées de cet emplacement. Attention à ne pas casser l’extrémité de la pipette sur le crâne.
10. Déplacez la pipette à l’emplacement d’enregistrement souhaité dans les axes antéro-postérieur et médiolatéral. Avancez ensuite la pipette ventralement à travers la dure-mère jusqu’à ce qu’elle soit à environ 500 μm dorsale de l’emplacement d’enregistrement prévu.
11. Faites avancer lentement la pipette tout en écoutant les événements de pic sur un moniteur audio de la tension amplifiée enregistrée entre la pointe de la pipette et le fil de référence. Une fois que les événements de dopage sont identifiés, continuez à déplacer la pipette de 0 à 100 μm jusqu’à ce que des déviations de tension positives supérieures à environ 500 μV soient observées.
    REMARQUE : La résistance de l’électrode augmentera d’un facteur d’environ 1,5-10 lorsque cela se produit.
12. L’enregistrement doit commencer une fois qu’une unité a été isolée, ainsi que toutes les autres mesures comportementales et physiologiques d’intérêt. Dans la présente démonstration, les mouvements des vibrissa auto-générés sont surveillés par vidéographie à grande vitesse (voir la section Matériaux ).
13. Pour étiqueter le site d’enregistrement, commutez les fils d’électrode pour qu’ils se connectent à la source de courant. Il y a plusieurs façons de le faire, en utilisant soit un circuit de relais(Figure 3A-C), soit une source de courant intégrée sur l’amplificateur, soit manuellement(Figure 3D). Passez -4 μA avec des impulsions de 2 secondes à 50 % de rapport cyclique pendant 4 min pour injecter ionophrétiquement Chicago Sky Blue à travers la pipette.
14. Tuer et perfuser l’animal après plusieurs procédures d’étiquetage selon la pratique courante. Sectionnez le cerveau et contre-colorez si nécessaire pour identifier l’emplacement anatomique du site d’enregistrement. Contre-coloration du tissu pour la réactivité de la cytochrome oxydase. Vous pouvez également identifier les dépôts de Chicago Sky Blue à l’aide de la microscopie à fluorescence.
    REMARQUE : Pour différencier précisément les différentes unités étiquetées, il est important que toutes les étiquettes soient fabriquées avec la même pipette le même jour, sans desserrer la pipette entre les étiquettes. Dans ce cas, les sites d’enregistrement peuvent être différenciés par leurs emplacements relatifs dans l’histologie post-hoc, ainsi que par les coordonnées du manipulateur notées de chaque site. Pour une identification sans ambiguïté, marquez les étiquettes à au moins 200 μm les unes des autres, et pas plus de 3 à 5 étiquettes par région du cerveau.

Résultats

Figure 1 : Gabarit expérimental. Schéma du rat dans le gabarit mécanique pour des expériences de surveillance électrophysiologique et comportementale. Le gabarit utilise la barre et la plaque

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ketaset (Kétamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (solution de xylazine)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip poudre de ciment	Dentsply Intl	675571	Pour la base de la chambre d’enregistrement
Grip ciment liquide	Dentsply Intl 675572		Pour la base de la chambre d’enregistrement
Gel de silicone	Dow Corning Mar-80
Poudre acrylique de réparation de prothèses dentaires à jet	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Pour fixer l’appuie-tête au crâne
Ortho-Jet Résine acrylique orthodontique liquide à polymérisation rapide	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Pour la fixation de l’appuie-tête au crâne
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldéhyde	Sigma	158127	Pour la perfusion et la fixation tissulaire
Saline tamponnée au phosphate	Sigma	P3813	Pour la perfusion et la fixation tissulaire
Cytochrome C	Sigma	C2506
Diaminobenzidine	Sigma	D5905
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A
PVC tube 2 1/2	U.S. Plastic Co.	34108
Broches et douilles subminiatures	TE Connectivity	205089-1
Fil à musique en acier inoxydable de 0,010" de diamètre	Precision Brand Products, Inc.	21010
Cadre de maintien stéréotaxique	Kopf Instruments	Modèle 900
Barres d’oreille stéréotaxiques	Kopf Instruments	Modèle 957
Manipulateur stéréotaxique	Kopf Instruments	Modèle 960
1/2 mm fraise de foret	Henry Schein	100-3995
Foret dentaire Quiet-Air	Midwest Dentaire	393-1600
Acier inoxydable 0-80 1/8 »	vis Fixation superstore	247438
0,2 mL tube	Fisher Scientific	05-407-8A
Barre de maintien de tête personnalisée	UCSD SIO Atelier d’usinage	N/A
Pince de poteau à angle droit	Newport	MCA-1
8-32 3/4 »	vis Fixation Superstore	240181
4-40 1/4" Fixation	Superstore	239958
Tube capillaire en quartz	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Micromanipulateur motorisé	Sutter Instruments	MP-285
Amplificateur de microélectrodes	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Pièce alternative : Dispositifs moléculaires Axoclamp 900A
Amplificateur à microélectrodes étage de tête	Dispositifs moléculaires	CV-7B	Pièce alternative : HS-9Ax10 avec dispositifs moléculaires Axoclamp 900A
Stimulateur d’impulsions isolé	A-M Systems	Modèle 2100	Pièce alternative : HS-9Ax10 avec dispositifs moléculaires Axoclamp 900A
Moniteur audio	Radio Shack	32-2040
Fil de plomb d’électrode	Fil de cooner	NEF34-1646
Relais pour étage de tête d’amplificateur	Technologie COTO	#2342-05-000	(en option) Utilisé avec une carte de circuit imprimé sur mesure (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Caméra vidéo numérique	Basler	A602fm
Porte-pipette	Warner Instruments	#MEW-F10T
Plaque de maintien de tête sur mesure	UCSD SIO Machine Shop	N/A

" centrifuge